Detecção de fungos associados ao declínio e morte de videiras no Rio Grande do Sul por técnicas de PCR

Abstract

As podridões de tronco da videira representam um problema ao setor vitivinícola mundial, em decorrência dos prejuízos gerados pelo declínio e morte de plantas causados por fungos fitopatogênicos. Dentre elas, destaca-se a “doença de Petri”, causada pela associação da espécie Phaeomoniella chlamydospora com várias espécies de Phaeoacremonium spp., e o ‘pé-preto’, causado pelas espécies de fungos dos gêneros Cylindrocarpon spp. e Ilyocnetria spp.. Muitas vezes, os agentes causadores dessas podridões do tronco da videira estão presentes na mesma amostra de tecido vegetal, dificultando a identificação dos mesmos por metodologias de diagnose clássica, que também são mais lentas e imprecisas. O objetivo deste trabalho foi ajustar e desenvolver métodos de PCR para detecção de fungos causadores dessas podridões, isolados de amostras infectadas em vinhedos comerciais no Rio Grande do Sul. Para isso, realizou-se a extração de DNA total da biomassa fúngica dos isolados pelo método fenol:clorofórmio:álcool:isoamílico. Ensaios de detecção dos patógenos por iniciadores específicos foram desenvolvidos. O par de iniciadores específicos Cylf e CylR foi aplicado para detecção específica dos agentes causais do ‘Pé-preto’ no DNA-molde dos isolados. Iniciadores específicos para identificação de Phaeomoniella chlamydospora (Pmo1 e Pmo2), Phaeoacremonium spp (Pal1N e Pal2) e Cylindrocarpon/Ilyonectria (CylF/CylR) também foram usados para detecção do DNA fúngico por PCR Nested, a partir de sequências-molde da região ITS1/2 obtidas com iniciadores ITS5 e ITS4. Foi possível ajustar um programa de amplificação para identificação das espécies associadas ao ‘Pé-preto’ em PCR direta e otimizar um programa de segunda rodada de PCR Nested para detecção específica de cada espécie estudada. A detecção dos fungos de podridão de tronco da videira é de extrema importância para a garantia da qualidade fitossanitária do material propagativo de videira, impedindo a contaminação de novas áreas de produção.

Grapevine trunk diseases represent a problem for the world wine sector, due to the damage caused by the decline and death of plants caused by phytopathogenic fungi. Among them, there is the “Petri disease”, caused by the association of Phaeomoniella chlamydospore species with several Phaeoacremonium spp. and 'black foot', caused by species of fungi of the genus Cylindrocarpon spp. and Ilyocnetria spp. Often, the causative agents of grapevine trunk diseases are present in the same sample of plant tissue, making it difficult to identify them by classical diagnostic methodologies, which are also slower and more imprecise. The objective of this work was to adjust and develop PCR methods for the detection of fungi that cause these diseases, isolated from infected samples in commercial vineyards in Rio Grande do Sul. For this, the total DNA extraction of the fungal biomass of the isolates was carried out by the phenol:chloroform:alcohol: isoamyl method. Assays for the detection of pathogens by specific primers were developed. The pair of specific primers Cylf and CylR was applied for the specific detection of the causative agents of 'black foot' in the template DNA of the isolates. Specific primers for the identification of Phaeomoniella chlamydospora (Pmo1 and Pmo2), Phaeoacremonium spp (Pal1N and Pal2), and Cylindrocarpon/Ilyonectria (CylF/CylR) were also used for detection of fungal DNA by Nested PCR, from template sequences of the ITS1 region /2 obtained with ITS5 and ITS4 primers. It was possible to adjust an amplification program to identify species associated with 'black foot' in direct PCR and to optimize a second round Nested PCR program for specific detection of each studied species. The detection of grapevine pathogens is extremely important to guarantee the phytosanitary quality of the vine propagation material, preventing the contamination of new production areas.